ИКСИ (ICSI)- инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита.

ИКСИ (ICSI)- инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита.


Стандартный метод экстракорпорального оплодотворения применяется для решения проблем женского бесплодия. При этом зрелый ооцит оплодотворяется большим количеством сперматозоидов, полученных из эякулята. Согласно рекомендациям ВОЗ, нижней границей нормы качества спермы для ЭКО является наличие 500 тыс подвижных сперматозоидов с поступательным движением в пробе после обработки. Метод ИКСИ предназначен для преодоления мужского бесплодия, то есть в случае низких фертильных качеств спермы:

• Олигозооспермии (низкой концентрации сперматозоидов)
• Астенозооспермии (низкой подвижности сперматозоидов)
• Тератозооспермии (плохой морфологии сперматозиодов)
• Положительного Mar- теста (связанных с антителами сперматозоидов)
• Иных недиагностированных и  неклассифицированных состояний, блокирующих оплодотворение в рамках классического экстракорпорального оплодотворения.   

Начиная с 1977г, когда в клинике Борн-Холл (Кэмбридж, Англия) была проведена первая удачная попытка экстракорпорального оплодотворения и в 1978г родилась Лиза Браун, в пылу всеобщего ликования родилось общественное мнение о полной победе над бесплодием. Однако уже совсем скоро стало ясно, что, несмотря на революционность открытия, помочь оно сможет лишь части всех нуждающихся. И парам, казалось бы, с неабсолютным мужским факторам бесплодия, имеющим сперматозоиды в эякуляте, все также приходится рекомендовать заимствование донорской спермы в попытке ВРТ, так как добиться оплодотворения и развития эмбриона в данном случае не удавалось даже в рамках инновационного ЭКО.  

Упрощенная суть методики ЭКО заключается в расположении подвижных сперматозоидов в непосредственной близости от яйцеклетки для обеспечения оплодотворения, что фактически  имитирует естественный процесс оплодотворения, когда сперматозоид самостоятельно проникает в ооцит и запускает процесс генетического объединения и появления нового биологического индивидуума.

Перед оплодотворением,  потенциальные сперматозоиды должны подвергнуться капацитации. Капацитация — это конечный этап созревания, дающий сперматозоидам способность взаимодействовать с ооцитом и проникать в него. Биохимически капацитация — это изменение строения некоторых молекул (стеролов, липидов и гликозилированных белков) цитоплазматической мембраны сперматозоида. Принципиально данные сложные изменения дают возможность сперматозоиду:

1. вступить в фазу гиперактивации
2. образовывать необходимые связи с рецепторами на поверхности прозрачной оболочки.
3. запустить физиологическую акросомальную реакцию

Известно, что семенная жидкость, преимущественно за счет содержания холестерина, способна блокировать капацитацию и вызывать декапацитацию у прошедших капацитацию сперматозоидов, поэтому оплодотворение невозможно без удаления компонентов семенной жидкости (отмывки сперматозоидов) в среде, связывающей холестерин. В процессе капацитации вероятно также утрачиваются рецепторы к фрукозе и маннозе, ингибирующих связывание интактного сперматозоида с зона пилюцида ооцита. Так же замечено, что у морфологически нормальных гамет гиперактивация происходит с большей вероятностью, чем у патологически измененных.


После капацитации в рамках естественного оплодотворения сперматозоид преодолевает три естественных барьера.

1. Комплекс клеток кумулюса и лучистого венца, окружающих ооцит. Продвижение сквозь барьер обеспечивается активностью  гиалуронидазы, разрушающей полимеризованную гиалуроновую кислоту. Важной эволюционной особенностью является то, что фермент выделяется погибшими сперматозоидами, приблизившимися к ооциту первыми.
2. Прозрачная оболочка (zona pellucida, ZP) ооцита. Этот барьер в основном представлен гликопротеинами (ZP-3 и ZP-2) имеет толщину всего 8–15 мкм. Важно, что только сперматозоид с нормальной морфологией и интактной акросомой способен взаимодействовать с гликопротеинами прозрачной оболочки, так как акросома сперматозоида содержит протеолитический фермент для расщепления прозрачной оболочки. Непосредственный диалог сперматозоида и ооцита начинается с момента прикрепления сперматозоида к zona pellucida. В этот момент запускается  акросомная реакция с высвобождением фермента акросомы, расщепляющей прозрачную оболочку, и позволяющей  сперматозоиду продвинуться в перивителлиновое пространство, где он встречается с последним барьером.
3. Цитоплазматическая мембрана ооцита (оолемма).

Контакт сперматозоида с оолемой запускает совершенно удивительный механизм- зонную реакцию, которая блокирует возможность другим сперматозоидам, имеющим потенциал к оплодотворению проникнуть в перивитилиновое пространство и занести лишний генетический материал (полиспермию). Старт процесса приводит с высвобождения внутриклеточного кальция из ооцита, что запускает высвобождение кортикальных гранул в перивителлиновое пространство (кортикальная реакция). Гранулы содержат протеиназы, изменяющие структуру гликопротеинов ZP-3 и ZP-2 до непроницаемости.

Прорвавшийся сперматозоид поглощается ооцитом путем фагоцитоза и уже следующим этапом ооцит готовится к объединению разных половинок генетических наборов.

В то время как в классическом экстракорпоральном оплодотворении преодоление преград возлагается на способности самих сперматозоидов, было замечено, что при низких фертильных качествах спермы, этого не происходит. Стало очевидно, что для обеспечения оплодотворения необходимы дополнительные оплодотворениевспомогающие способы в перемещении сквозь естественные барьеры. Именно в этом направлении и двинулась исследовательская мысль. Так первый шаг сделали Cohen с соавт. и Tucker с соавт, предложив в качестве дополнительной методики технику частичного механического рассечения прозрачной оболочки, позволяя сперматозоидам беспрепятственно проникать в перивителлиновое пространство, минуя два первых (клетки кумулюса и лучистого венца и прозрачную оболочку) барьера. Laws-King и соавт. в 1987г усовершенствовали эту методику, вводя единичные (5-20) подвижные сперматозоиды в перивителлиновое пространство, используя специальную стеклянную иглу. Предложенные инновации иногда позволяли добиться оплодотворения, однако частота нормального оплодотворения, к сожалению, все еще оставляла желать лучшего, практически не позволяя использовать технологии в практической репродукции. Все кардинально изменилось в 1992г, когда родился первый в мире ребенок после новейшей процедуры, названной ICSI (ИКСИ). Технология принципиально отличалось от рассматриваемых ранее тем, что подготовленный сперматозоид вводился непосредственно внутрь яйцеклетки, минуя все барьеры и этап фагоцитоза сперматозоида из перивитилинового простанства (Palermo и соавт., Центр репродуктивной медицины Университетской клиники г. Брюсселя (CRG of UZ Brussel). Ни тогда, ни сейчас нет сомнений в революционности этого открытия, по праву считающегося самым значимым после открытия самой методики ЭКО в репродукции человека. Объективно можно сказать, что с этого момента репродуктивная медицина, наконец, повернулась ко второй половине человечества, и уже всерьез можно было говорить о коррекции мужского бесплодия. Технология ИКСИ позволила добиваться потомства при наличии единственных сперматозоидов, иногда даже если они получены непосредственно из яичка или его придатка (PESA, TESA, TEFNA, MESA, TESE, m-TESE), так как для оплодотворения одного ооцита стал требоваться только один  сперматозоид.

Методика ИКСИ позволила исправить две конкретные клинические проблемы:

1. низкие фертильные качества спермы.
2. неудачные ранее попытки оплодотворения в циклах классического ЭКО при нормальных оценочных показателях спермограммы

Кстати можно заметить, еще одной интересной особенностью методики явилось то, что дальнейшие активные попытки расширить показания к удивительному методу лечения ИКСИ оказались сравнительно неоправданными, так и закрепив изначальные показания. 

В рамках ИКСИ используется только жизнеспособный (живой) сперматозоид. Известно, что при некрозооспермии (нежизнеспособных сперматозоидов) оплодотворение не происходит. Понятным признаком жизнеспособности сперматозоида является его подвижность, при этом поступательность движения отражает потенциал сперматозоида в оценке критерия подвижности. Поэтому при выборе предпочтение всегда отдается правильно движущемуся сперматозоиду. Однако эмбриолог далеко не всегда имеет выбор, порой располагая для оплодотворения лишь единичными неподвижными сперматазиодами, например, в рамках протоколов с хирургическим получением мужских гамет. При этом важно понимать, что неподвижный не значит неживой.

Тесты определения жизнеспособности сперматозоидов в рамках протокола ИКСИ:

• тест  механического контакта (de Oliveira и соавт. в 2004 г.);
• тест нагревания хвоста сперматозоида лазерным ударом (laser assisted immotile sperm selection, LAISS);
• тест активации с пентоксифиллином (Terriou и соавт. в 2000 г.);
• тест набухания в гипоосмотической (разбавленной водой) среде.

Характеристики сперматозоида
Несмотря на кажущуюся очевидность правила выбора морфилогически и кинетически нормального сперматозоида для оплодотворения методом ИКСИ, исследования, проведенные в этом направлении довольно противоречивы. Так Nagy и соавт. в 1995 г. сообщили, что результаты ИКСИ не зависят от таких показателей эякулята, как концентрация, подвижность и морфология, а De Vos с соавт. сообщил, что морфология инъецируемого сперматозоида не оказывает значимого влияния на результат цикла ИКСИ. Напротив, ряд исследований взвешивающих морфологический фактор в рамках усложненных методик оценки под большим увеличением (ИМСИ) показали более высокую частоту оплодотворения и наступления беременности при инъекции морфологически отобранного сперматозоида (например, Antinori и соавт. в 2008 г). Тем не менее, несмотря на неоднозначность мнения, практикующие эмбриологи, как правило, пропагандируют правило «идеального сперматозоида» при выборе мужской гаметы для проведения инъекции, мотивируя тем, что лечение максимально приближается по логике к естественному зачатию, с чем довольно сложно спорить.  

При отсутствии активации ооцита инъецированным сперматозоидом (его фактором активации фосфолипазы С-zeta), применяется иономицин. Подход предложен Heindrickx и соавт в 2005г, как дополнительный метод ведения пациентов с глобозооспермией (сперматозоиды с круглой головкой, без акросомы) и при повторных неудачных попытках оплодотворения путем ИКСИ.

Характеристики ооцита
Так же нет единого мнения относительно качества ооцита по визуальным характеристикам и результативности программы ИКСИ. Если не останавливаться на безобидных особенностях женских гамет, то стоит упомянуть исследования Ebner и соавт., которые отметили, что наличие скопления гладкого эндоплазматического ретикулума (2008г), вакуолей (2005г) может расцениваться, как негативный фактор. Kahraman и соавт. в 2000 заметили снижение потенциала к имплантации у ооцитов с грануляцией, а Otsuki и соавт., 2007 у ооцитов с липофусциновыми тельцами.

Суть методики:


После получения спермы, производится ее обработка, необходимость обработки спермы объясняется следующими причинами:

• необходимостью капацитации сперматозоидов
• необходимостью выделения фракции подвижных, а в идеале- с поступательным движением, сперматозоидов
• необходимостью фильтрации погибших сперматозоидов и посторонних клеток.

Существуют различные методы обработки спермы для ИКСИ, выбор зависит от характеристик эякулята и правил, предусмотренных в конкретной IVF лаборатории

На практике, обработка образцов спермы может осуществляться следующими способами:

• Однократная (Edwards в 1969г) или двойная отмывка сперматозоидов культуральной средой с последующим центрифугированием. Самый простой метод, применяется чаще всего к эякуляту хорошего качества. К недостаткам  методики принято относить образование активных форм кислорода в осадке клеток после центрифугирования, что может объективно сказываться на сохранности генетического груза жизнеспособных сперматозоидов.
• Флотация, как наиболее часто используемый из методов миграции сперматозоидов. Подход имитирует естественное перемещение сперматозоидов через цервикальную слизь. При этом фракция спермы располагается под фракцией культуральной среды, что позволяется прогрессивно подвижным сперматозоидам переместиться во фракцию среды. К недостатку методики следует отнести неадекватность подхода при выраженной астенозооспермии.
• Центрифугирование спермы в градиенте плотности позволяет отобрать подвижные сперматозоиды с нормальной морфологией. Метод основан на принципе центрифугирования спермы через градиент, образованный, двумя-тремя слоями растворов с возрастающей плотностью (масса/объем), содержащих различные концентрации частиц коллоидного кремния, покрытых силаном. Соответственно, подход основан на разделении компонентов (клеток) эякулята по их плотности.  Образец спермы располагается поверх градиента. После центрифугирования сперматозоиды, получаемые со дна пробирки, обладают наибольшей подвижностью. Подход применяется многими лабораториями IVF, как штатный способ обработки спермы низкого качества.
• Другие подходы обработки, например методы фильтрации (в колонках из стекловолокна, стеклянных гранул или поперечно-сшитого декстранового геля), которые используются крайне редко в силу их неоправданной трудоемкости.

Принцип метода ИКСИ прост- сперматозоид механически перемещается непосредственно в яйцеклетку, минуя все три барьера.

Первый барьер- клетки кумулюса и лучистого венца удаляются до проведения инъекции сперматозоида, этот процесс принято называть денудацией ооцита, техника предложена Van de Velde с соавт., выполняется в два этапа:

1. ферментативное расщепление гиалуронидазой, вспомним, в естественных условиях этот фермент выделяется погибшими сперматозоидами, приблизившимися к ооциту первыми
2. механическое отмывание, путем колебания пипеткой-стриппером.

Второй и третий барьеры (прозрачная оболочка и оолемма) прокалываются одномоментно путем направленной инъекции специальной микроиглой, несущей сперматозоид.


Инъекция сперматозоида выполняется под большим увеличением (х400) инвертированного микроскопа. Свободная работа с гаметами обеспечивается микроманипуляционной гидравлической или электрической техникой, позволяющей трансформировать масштаб движения руки эмбриолога в направленное микродействие.

Инструмент, контактирующий с ооцитом, принято назвать микроприсоской, располагается на 9 часах, инъекционная игла, несущая сперматозоид называется инъекционной микропипеткой, располагается в поле зрения инвертированного микроскопа напротив микроприсоски — в положении 3 часов.

Несмотря на простую суть ИКСИ, тонкости технологии очень сложны. Например, среди особенностей имеет принципиальное значение даже такой казалось бы неощутимый фактор, как угол микропипетки.

Для снижения скорости сперматозоидов используется специальная вязкая среда с поливинилпирролидоном (ПВП), облегчающая микроманипуляции со сперматозоидами. Перед манипуляцией сперматозоид иммобилизуется путем перетирания срединной части хвоста резкими движениями инъекционной микропипетки. Данная техника способствует высвобождению  фосфолипазы C-zeta- фактора активации ооцита. Ооцит располагается так, чтобы его первое полярное тельце находилось в области 6 или 12 часов, инъекция выполняется в области 3 часов, считается, что такой подход обеспечивает наиболее щадящее манипулирование с ооцитом. Микроинъекция выполняется одномоментно мягким непрерывным движением в покрытой маслом культуральной среде с буфером Hepes. Время для проведения манипуляции выбирается таким образом, чтобы не пропустить время оценки факта правильного оплодотворения (примерно через 16-19 часов после инъекции (Nagy и соавт. 1994 г). После инъекции, ооциты по одному перемещаются в среду для дальнейшего культивирования, чашки укладываются в инкубатор.

В руках практикующего эмбриолога основная часть манипуляции выглядит так:


В завершение можно отметить, что у пациентов с пограничным качеством спермы, не имеющих опыт экстракорпорального оплодотворения, возможно сочетание двух методов оплодотворения (классического ЭКО и ИКСИ) в одном цикле лечения. Данная тактика используется довольно широко, несмотря на то, что сравнительное исследование (Tournaye и соавт. 2002г.) продемонстрировало большую эффективность ИКСИ над ЭКО в случаях использования спермы пограничного качества. Verheyen с соавт. в 1999 г показали высокую эффективность ИКСИ над ЭКО в парах с астенозооспермией. Что касается женского бесплодия, то Staessen и соавт. в 1999г. отметили сравнительную эффективность ЭКО и ИКСИ в парах с изолированным трубным фактором. А Tournaye и соавт. в 2002 г. подчеркнули отсутствие преимуществ ИКСИ над ЭКО при оплодотворении высокой концентрацией сперматозоидов, еще раз закрепив принятые ранее показания:

1. неудачные ранее попытки оплодотворения в циклах классического ЭКО
2. низкие фертильные качества спермы.

Новый комментарий